體視顯微鏡通常是實(shí)驗(yàn)室或生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)對(duì)樣品進(jìn)行三維感知時(shí)的第一選擇。用戶(hù)經(jīng)?；ㄙM(fèi)大量時(shí)間通過(guò)目鏡對(duì)樣品進(jìn)行顯微分析、觀察、記錄或解剖。因此必須認(rèn)真選擇顯微鏡以確保滿(mǎn)足用戶(hù)的需求。本文建議用戶(hù)在評(píng)估和選擇顯微鏡之前，仔細(xì)思考自身的需求。本文還描述了哪些關(guān)鍵因素會(huì)影響體視顯微鏡的性能，這對(duì)于用戶(hù)的具體應(yīng)用而言非常重要。
什么時(shí)候應(yīng)該優(yōu)先選擇體視顯微鏡？
體視顯微鏡的特點(diǎn)在于能夠生成樣品的三維圖像。因此，它們特別適合用于制造環(huán)境中的顯微分析和重復(fù)作業(yè)、質(zhì)量控制、研發(fā)，或者故障分析。它們還能用于生命科學(xué)領(lǐng)域的標(biāo)本分類(lèi)、篩選和處理，以及學(xué)校教室和大學(xué)實(shí)驗(yàn)室的教學(xué)活動(dòng)。
圖1：對(duì)汽車(chē)行業(yè)的零部件生產(chǎn)進(jìn)行顯微分析：使用體視顯微鏡以近垂直照明方式拍攝的鏈輪圖像
步驟1：
了解您的需求
開(kāi)始選擇體視顯微鏡之前，您應(yīng)該思考使用顯微鏡的應(yīng)用類(lèi)型以及使用地點(diǎn)和設(shè)置這些因素對(duì)于您的決定會(huì)產(chǎn)生重要影響。
思考樣品
需要觀察哪些類(lèi)型的樣品？是否需要適應(yīng)不同類(lèi)型的樣品，或者只是為了實(shí)現(xiàn)高效率而適應(yīng)同一類(lèi)樣品？需要觀察哪些樣品結(jié)構(gòu)？您是否需要觀察反射樣品，例如金屬零部件，或者查看孔洞？樣品會(huì)有多大？如果您專(zhuān)注于生命科學(xué)應(yīng)用，是否需要熒光成像？
您查看的樣品種類(lèi)和大小決定了使用哪種照明類(lèi)型，物鏡下方需要多少空間，以及選擇哪種載物臺(tái)。
思考應(yīng)用
您究竟需要如何處理樣品？除了觀察樣品，您是否需要記錄和測(cè)量？您是否需要與同事或?qū)W生討論圖像或測(cè)量結(jié)果？您的任務(wù)是否涉及在使用顯微鏡觀察樣品的同時(shí)，對(duì)樣品進(jìn)行篩選分類(lèi)或處理？
這些問(wèn)題的答案會(huì)影響到顯微鏡在設(shè)置選項(xiàng)，例如，是否使用帶顯示屏的獨(dú)立解決方案，是否需要單獨(dú)的顯示器，分享功能是否重要，或者是否需要相機(jī)進(jìn)行記錄。
思考用戶(hù)
顯微鏡是否有多位用戶(hù)，如果是，有多少位？每位用戶(hù)使用顯微鏡的時(shí)間有多長(zhǎng)？
根據(jù)用戶(hù)數(shù)量，顯微鏡應(yīng)當(dāng)能夠快速適應(yīng)每位用戶(hù)的喜好和體型。如果用戶(hù)長(zhǎng)時(shí)間使用顯微鏡，符合人體工程學(xué)的配件對(duì)于防止因重復(fù)動(dòng)作引起身體損傷至關(guān)重要。
思考預(yù)算
需要多少臺(tái)顯微鏡，有多少預(yù)算？
有各種價(jià)位的體視顯微鏡可供選擇。了解您預(yù)算多少，有助于您優(yōu)先考慮或者挑選符合自身需求的模塊化解決方案。請(qǐng)記住，模塊化解決方案的初始投資盡管看起來(lái)更高，但從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看，由于其用途廣泛，可以滿(mǎn)足不同用戶(hù)需求，以及擁有種類(lèi)繁多的配件，它們或許可以為您節(jié)省資金。
步驟2：
做出明智的決定
在評(píng)估不同選項(xiàng)時(shí)，必須清楚了解決定體視顯微鏡性能的關(guān)鍵因素以及使用這類(lèi)顯微鏡的用戶(hù)。以下概述了需要思考的關(guān)鍵因素。這些要點(diǎn)簡(jiǎn)要描述了最為重要的方面。概述后面的深入探討將為您提供有關(guān)上述每個(gè)方面的更多詳細(xì)信息。
01
變焦范圍、放大倍率、物場(chǎng)（視場(chǎng)）和工作距離
體視顯微鏡光學(xué)器件的變焦范圍定義了高和低放大倍率之間的縮放范圍。通常以相同放大倍率工作的用戶(hù)不需要較大的變焦范圍。如果工作流程需要在物鏡下處理樣品或搜索樣品以找到感興趣區(qū)域，那么可能需要較大的變焦范圍，因?yàn)槟菢涌梢宰屇鷱牟榭锤庞[快速切換到微小細(xì)節(jié)。
根據(jù)具體的目鏡，在相同的放大倍率下，可以看到更大或更小的視場(chǎng)或物場(chǎng)。更大的視場(chǎng)允許用戶(hù)在樣品上保持更好的定位。
工作距離是指樣品頂部與物鏡前鏡片之間的距離。對(duì)于顯微分析和重復(fù)作業(yè)或者樣品分類(lèi)，較大的工作距離會(huì)很有幫助，因?yàn)檫@可以幫助您在使用顯微鏡觀察樣品時(shí)更方便地處理樣品。
02
景深、分辨率和數(shù)值孔徑（NA）
景深表示用戶(hù)認(rèn)為有多少樣品（就垂直高度而言）處于對(duì)焦?fàn)顟B(tài)。它與數(shù)值孔徑、分辨率和放大倍率呈負(fù)相關(guān)。
分辨率代表用戶(hù)可以在樣本中看到多少細(xì)節(jié)。
數(shù)值孔徑與浸沒(méi)樣品和物鏡的介質(zhì)的折射率以及透鏡收集的最大光錐角度有關(guān)。數(shù)值孔徑越大，分辨率越高，但景深通常降低。
FusionOptics結(jié)合了更高的分辨率和更大的景深。
03
光學(xué)系統(tǒng)質(zhì)量
光學(xué)系統(tǒng)質(zhì)量決定了樣品的成像精度
色差和球差是導(dǎo)致彩色條紋和圖像失真的光學(xué)現(xiàn)象。
根據(jù)樣品和任務(wù)的不同，對(duì)于光學(xué)系統(tǒng)質(zhì)量可能會(huì)有不同的要求，例如，如果看到樣品的真實(shí)顏色很重要，則需要光學(xué)器件進(jìn)行顏色校正。
如果需要視覺(jué)呈現(xiàn)樣品細(xì)節(jié)，例如，對(duì)于研發(fā)（R&D）等應(yīng)用，建議使用更具透光性的光學(xué)器件。
圖2：物鏡和顯微鏡光學(xué)器件的質(zhì)量在很大程度上決定了圖像質(zhì)量
04
照明
照明應(yīng)均勻地照亮整個(gè)視場(chǎng)，提供良好的對(duì)比度，并顯示樣品的真實(shí)顏色。參考文獻(xiàn)12列出的文章顯示了不同照明的示例及其對(duì)圖像的影響。
重要的是，照明可以滿(mǎn)足所用顯微鏡和預(yù)期應(yīng)用的要求。
圖5：照明決定了可以看到樣品中的哪些細(xì)節(jié)。
05
人體工學(xué)
如果用戶(hù)長(zhǎng)時(shí)間通過(guò)目鏡觀察，他們會(huì)有拉傷肌肉的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)而導(dǎo)致肌肉骨骼類(lèi)疾病。此類(lèi)健康問(wèn)題可能導(dǎo)致注意力無(wú)法集中、工作效率下降，甚至缺勤。
符合人體工學(xué)的配件可幫助用戶(hù)在使用顯微鏡時(shí)保持正確的姿勢(shì)。
顯微鏡的可調(diào)功能，如變焦和對(duì)焦旋鈕，可幫助用戶(hù)自定義操作和設(shè)置，這在有多個(gè)用戶(hù)時(shí)尤為重要。
1
變焦范圍、放大倍率、物場(chǎng)（視場(chǎng)）和工作距離
體視顯微鏡的總放大倍率是物鏡、變焦光學(xué)器件和目鏡的放大倍率的乘積。
物鏡的放大倍率是固定值。變焦光學(xué)器件能夠在變焦系數(shù)范圍內(nèi)改變放大倍率。目前的放大倍率同樣是固定值。
為了確定通過(guò)目鏡觀察到的樣品的總放大倍率，需要將物鏡、變焦光學(xué)器件和目鏡的放大倍率相乘。
總放大倍率的公式為：MTOT VIS = MO × z × ME，其中：
MTOT VIS表示總放大倍率（VIS代表“視覺(jué)"）；
MO表示物鏡放大倍率（1×代表沒(méi)有額外透鏡的Greenough根林諾夫顯微鏡）；
Z表示變焦系數(shù)；
ME表示目鏡放大倍率。
通常MO的值介于0.32×到2×之間，z的值介于0.63×和16×之間，ME的值介于10×和40×之間。
放大倍率對(duì)視場(chǎng)/物場(chǎng)的影響
目鏡觀察時(shí)，可以看到一個(gè)稱(chēng)為視場(chǎng)（FOV）的圓形區(qū)域。視場(chǎng)的直徑取決于總放大倍率。例如，目鏡的放大倍率為10×，則視場(chǎng)數(shù)為23。視場(chǎng)數(shù)意味著在物鏡和變焦光學(xué)器件的綜合放大倍率為1×的情況下，通過(guò)目鏡觀察到的視場(chǎng)直徑為23毫米。
工作距離是對(duì)焦時(shí)物鏡前鏡片與樣品頂部之間的距離。通常，隨著放大倍率的增加，物鏡的工作距離會(huì)減少。工作距離會(huì)直接影響體視顯微鏡的操作使用，特別是需要留出一定空間以便操作樣品的顯微分析、重復(fù)作業(yè)以及質(zhì)量控制任務(wù)。
2
景深、分辨率和數(shù)值孔徑（NA）
景深、放大倍率和分辨率之間的關(guān)系
景深與數(shù)值孔徑、分辨率以及放大倍率呈負(fù)相關(guān)。
為了獲得樣品良好的視覺(jué)效果，適當(dāng)調(diào)整顯微鏡設(shè)置可以在景深和分辨率之間實(shí)現(xiàn)最佳平衡。特別是在低倍率下，可以通過(guò)降檔，即減少數(shù)值孔徑來(lái)顯著增加景深。目標(biāo)是根據(jù)樣品特征的大小和形狀實(shí)現(xiàn)分辨率和景深的平衡。
采用FusionOptics技術(shù)優(yōu)化三維圖像
體視顯微鏡的一項(xiàng)精密光學(xué)功能，利用徠卡顯微系統(tǒng)的FusionOptics技術(shù)同時(shí)獲得高分辨率和大景深。一條光路提供更高分辨率和更低景深的圖像，另一條光路提供更低分辨率和更大景深的圖像。人腦可以將這兩張單獨(dú)的圖像合成為一張具有高分辨率和高景深的圖像。
圖3：體視顯微鏡有條獨(dú)立的光路（1）。借助FusionOptics技術(shù)，一條光路可提供大景深（2），另一條光路可以提供高分辨率（3）。人腦可將兩幅圖像合成為一幅優(yōu)化的三維圖像（4）。
3
光學(xué)系統(tǒng)質(zhì)量
消色差或復(fù)消色差透鏡
色差是一種失真現(xiàn)象，其原因是鏡頭未能將所有顏色聚焦到同一個(gè)會(huì)聚點(diǎn)。這是因?yàn)橥哥R對(duì)不同波長(zhǎng)的光（透鏡的色散）具有不同的折射率。照射在遠(yuǎn)離球面中心軸線(xiàn)的位置的光線(xiàn)折射到靠近中心的位置時(shí)，就會(huì)發(fā)生球面相差.
優(yōu)秀的光學(xué)設(shè)計(jì)旨在減少消除色差和球面相差。以下幾類(lèi)物鏡可以用于限制這些問(wèn)題的影響：
消色差
針對(duì)聚焦在同一平面上的兩種波長(zhǎng)（紅色和綠色）進(jìn)行色度校正。
非常適合可見(jiàn)光譜范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用，因?yàn)檎鎸?shí)色彩再現(xiàn)并不重要，主要評(píng)估幾何特征。
復(fù)消色差
針對(duì)聚焦在同一平面上的三種波長(zhǎng)（紅色、綠色和藍(lán)色）進(jìn)行色度校正。
適用于在可見(jiàn)光譜范圍內(nèi)外具有最高規(guī)格的應(yīng)用，因?yàn)檫@種應(yīng)用中的彩色條紋可能會(huì)令人不安，例如那些需要快速切換和結(jié)構(gòu)共定位的應(yīng)用。
平面
未針對(duì)視場(chǎng)平坦度或平面度進(jìn)行校正的鏡頭會(huì)在整個(gè)視場(chǎng)范圍內(nèi)顯示不均勻的焦點(diǎn)。
圖像平坦度校正對(duì)于許多應(yīng)用都很用，尤其是需要大視場(chǎng)的應(yīng)用。
4
不同照明類(lèi)型
入射光
用于不透明樣品根據(jù)樣品紋理和應(yīng)用要求，可以使用許多不同的入射光照明解決方案，以便對(duì)樣品的相關(guān)細(xì)節(jié)和特征進(jìn)行合理對(duì)比。
透射光
用于各種透明樣品，從細(xì)胞和模型生物等生物樣品到聚合物和玻璃等材料。
標(biāo)準(zhǔn)透射光明場(chǎng)照明
用于所有類(lèi)型的透明樣品?？梢蕴峁└邔?duì)比度以及充分的色彩信息。
傾斜透射光照明
用于接近透明的無(wú)色樣品。樣品可以達(dá)到出色的對(duì)比度和視覺(jué)清晰度。
暗場(chǎng)照明
用于樣品平坦區(qū)域的小型特征，后者在明場(chǎng)下不易看到，例如閃亮或明亮樣品上的裂縫、孔隙、細(xì)小突起等。它還可用于顯示尺寸低于分辨率限制的樣品結(jié)構(gòu)。
5
人體工學(xué)
詳細(xì)內(nèi)容：人體工學(xué)設(shè)計(jì)，高效獲取結(jié)果
通常，每個(gè)人的體質(zhì)和工作習(xí)慣各不相同。因此，顯微鏡目鏡的高度可能并不適合每位用戶(hù)。如果觀察高度太低，觀察者在工作時(shí)必須向前彎曲身體，導(dǎo)致頸部肌肉緊張。為了補(bǔ)償這種高度差，建議使用可變雙目鏡。徠卡顯微系統(tǒng)提供種類(lèi)廣泛的人體工學(xué)配件，有助確保工作流程高效執(zhí)行。
圖4：ErgoTube目鏡鏡筒有助用戶(hù)確保身體和頭部始終處于最為放松的位置，讓手臂得到良好支撐，腿部擁有足夠空間，并且舒適地坐在椅子上。
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